توصیه های عملی در بخش مولکولی عفونی

مطالب حاضر بر اساس ویژگی های استاندارد یک آزمایشگاه مولکولی عفونی تهیه شده و به تفکیک، نکات ضروری در بخش های مختلف آزمایشگاه مولکولی عفونی و همچنین مراحل مختلف کار را بیان کرده و راه کارهای بهبود کیفیت انجام تست ها را ارائه می دهد.

1) جداسازی فضا و روند کار یکطرفه
با توجه به اصولی که در طراحی بخش مولکولی عفونی وجود دارد، به منظور حصول بهترین نتایج توصیه می شود تا حد ممکن 3 فضای جداگانه جهت انجام استخراج، آماده سازی Mastermix و همچنین انجام PCR در نظر گرفته شود تا احتمال آلودگی تیوب های انجام واکنش و همچنین ویال ریجنت ها به حداقل رسد.

اتاق استخراج، مخصوص انجام پروسه آماده سازی نمونه و همچنین استخراج می باشد. این فضا جزو آلوده ترین فضاها محسوب می شود و می بایست از هود کلاس 2 با فیلتر هپا جهت استخراج استفاده کرد.

اتاق Cleanroom صرفا مخصوص نگهداری از ریجنت ها و همچنین آماده سازی Mastermix می باشد. به همین دلیل می بایست عاری از آلودگی به نوکلئیک اسید باشد و حتی کنترل مثبت، استاندارد و کنترل داخلی در این اتاق نگهداری نشود. همچنین رفت و آمد در این فضا نیز باید محدود باشد تا از بروز آلودگی جلوگیری گردد.

اتاق PCR مخصوص آماده کردن تیوب های واکنش و اضافه کردن Mastermix و Elution به آن می باشد. همچنین دستگاه ترموسایکلر نیز در این اتاق قرار دارد. از آنجایی که کنترل مثبت و استاندارد ها در این اتاق باز و مورد استفاده قرار می گیرند، لازم است احتیاط های لازم به عمل آید تا از احتمال بروز آلودگی جلوگیری به عمل آید. همچنین توجه شود که در این اتاق به هیچ عنوان نباید درب تیوب های واکنش بعد از اتمام کار باز شود در غیر این صورت PCR product می تواند در تمام فضا پخش شود و مشکلات ثانوی را ایجاد نماید.

2) دستگاه ترموسایکلر
دستگاه مناسب برای انجام تست های Multiplex Real-time PCR باید قابلیت خوانش در 4 کانال سبز، زرد، نارنجی و قرمز را داشته باشد. همچنین از صحت عملکرد آن باید اطمینان حاصل کرد که این کار به واسطه سرویس های دوره ای صورت می پذیرد. همچنین بعضی دستگاه ها نیاز به تنظیمات خاصی قبل انجام تست می باشند که باید مطابق با توصیه های کیت انجام شود.

3) استخراج
به طور کلی در مرحله استخراج، رعایت اصول ضدعفونی کردن جهت جلوگیری از آلودگی نمونه ها، انتخاب پروتکل و حجم مناسب استخراج با توجه به نوع نمونه و استفاده از کنترل داخلی جهت حصول اطمینان از کیفیت ماده استخراج شده از جمله موارد مهمی است که در این مرحله پیروی از آن ها توصیه می گردد.

انجام یک روند استخراج کامل و موفق نیازمند توجه به نکات متعدد و رعایت موارد مختلفی است. در ادامه به موارد عمومی آن پرداخته می شود. از آنجا که در این مرحله با نمونه اولیه بیمار کار می شود باید تمامی نکات ایمنی رعایت شود تا از انتقال آلودگی به پرسنل جلوگیری شود. همچنین به منظور جلوگیری از آلودگی تیوب به تیوب باید اصول ضد عفونی به طور کامل و صحیح رعایت شود و قبل از شروع هر ران کاری هود و محل انجام تست ضد عفونی گردد. از طرف دیگر هنگام کار باید دقت داشت که نحوه استفاده از تجهیزات از جمله سمپلر، سرسمپلر، سانتریفیوژها، تیوب ها و انواع ریجنت ها بسیار اهمیت دارد و در صورت عدم رعایت اصول مربوطه، به راحتی نتیجه کار تحت تاثیر قرار خواهد گرفت.

یکی از موضوعات مهم در انجام استخراج استفاده از نمونه مناسب برای پاتوژن مورد نظر می باشد، چراکه اگر نمونه اشتباه باشد و یا به درستی گرفته نشده باشد و یا حتی نگهداری و انتقال آن به خوبی صورت نگرفته باشد، عملا کار از همان ابتدا خراب شده و نتیجه مورد انتظار حاصل نخواهد شد. همچنین باید توجه داشت که بعضا برای نمونه های مختلف باید پروتکل های مختلف بکار برد و یا مرحله آماده سازی قبل انجام استخراج باید صورت پذیرد. پر واضح است که نحوه استخراج نمونه های مختلف از جمله خون، مایع مغزی نخاعی، خلط، مدفوع، ناخن و غیره با یکدیگر شبیه نیستند.

یکی دیگر از مواردی که باید به آن توجه کرد تجهیزات مناسب برای انجام کار است. باید یک ست سمپلر مخصوص این بخش قرار داده شود و همچنین باید از سرسمپلر های فیلتردار استفاده نمود تا از آلوده شدن سمپلر جلوگیری شود. همچنین سانتریفیوژ با دور مناسب هم یکی از موارد ضروری این بخش می باشد.

به منظور حصول اطمینان از انجام درست استخراج باید دو کار انجام شود؛ یکی استفاده از کنترل منفی، که بدین صورت خواهد بود که یک تیوب حاوی بافر(کنترل منفی موجود در کیت و یا Elution بافر و یا PBS) در کنار دیگر نمونه ها استخراج می شود و در مرحله PCR وجود پاتوژن در آن مورد بررسی قرار خواهد گرفت و دیگری استفاده از کنترل داخلی موجود در کیت، به این ترتیب که در مراحل اولیه استخراج مقدار معینی از کنترل داخلی که توالی مشخصی دارد به نمونه بیمار و همچنین کنترل منفی اضافه شده و بعدا در مرحله PCR وجود آن مورد بررسی قرار میگیرد و در صورت مثبت شدن نشان دهنده انجام صحیح پروسه استخراج می باشد.

به طور کلی میزان نمونه اولیه و حجم Elution در حساسیت تست نیز تاثیر بسزایی دارد. به همین منظور در صورت لزوم و یا احتمال پایین وجود پاتوژن در نمونه، می توان حجم نمونه اولیه را بدون افزایش حجم Elution، بالا برد. تا بدین ترتیب احتمال پیدا کردن پاتوژن افزایش یابد.

4) نگهداری کیت ها و مواد آزمایشی
توصیه می شود به طور کلی ریجنت ها و مواد حاوی نوکلئیک اسید (از جمله نمونه بیمار، کنترل داخلی، کنترل مثبت و استاندارد) در فریزرهایی جدای از بقیه ریجنت های کیت نگهداری شوند. از طرف دیگر، بهتر است که ریجنت ها(پرایمر/پروب، بافر و استاندارد و کنترل مثبت) متناسب با میزان مصرف به نحوی الیکوت گردد که در نهایت بیش از 9 بار چرخه فریز و دفریز تکرار نشود تا حساسیت کیت کاهش نیابد. در نظر داشته باشید که آنزیم و کنترل داخلی نباید الیکوت گردد.

5) رعایت پروتکل های تست ها
توصیه می شود که از دستورالعمل های تست که در دفترچه راهنما ذکر شده، پیروی شود تا از بروز اشتباهات احتمالی جلوگیری شود. بر این اساس، تغییر و کاهش مقادیر تعیین شده جهت آماده سازی Mastermix و حجم واکنش به هیچ عنوان توصیه نمی گردد چرا که بر روی حساسیت کیت تاثیر گذاشته و می تواند در تشخیص موارد مثبت ضعیف دچار مشکل شود. از طرف دیگر، توصیه می شود که دفترچه راهنما به طور دقیق مطالعه گشته و همچنین در صورت لزوم، با شرکت جهت تنظیم صحیح دستگاه مشورت شود تا از کیفیت نتایج حاصله اطمینان حاصل شود.

6) کارشناس بخش
پرسنل بخش مولکولی باید با اصول کلی انجام تست های Real-time PCR آشنایی داشته باشند تا بتوانند بدون مشکل طبق پروتکل های موجود تست ها را انجام و نتایج حاصله را تفسیر نمایند.

7) تجهیزات اولیه بخش مولکولی
همان طور که در بخش های قبل به آن اشاره شد داشتن تجهیزات مناسب امری ضروری است. توصیه می شود هر اتاق ست سمپلر جداگانه خود را داشته باشد و همچنین از سرسمپلرهای RNase free فیلتردار مناسب سمپلر استفاده شود تا نهایت اطمینان از نتیجه حاصل شود. از طرف دیگر، برای جابجایی نمونه ها و انجام کارها می بایست از رک مناسب استفاده شود و پس از هر ران کاری رک ها اتوکلاو شوند. دیگر اجزا از جمله spin سانتریفیوژ و سانتریفیوژ با دور مناسب جهت استخراج نیز جز لاینفک این بخش می باشد.
8) پروتکل های ضد عفونی کردن

پروتکل های ضدعفونی کردن در بخش مولکولی اندکی با بخش های دیگر تفاوت دارد. منابع آلودگی در این بخش نوکلئیک اسید می باشد و نه صرفا پاتوژن زنده. بنابراین حتی اگر پاتوژن کشته شود اما نوکلئیک اسید آن سالم بماند می تواند روی نتایج کار تاثیر منفی داشته باشد. در این راستا، بخشی از پروتکل های مربوط به این بخش با این هدف باید انجام شود. ترکیبات حاوی کلر و یا نیتروژن فعال می تواند این کار را به خوبی انجام دهند. آب ژاول یکی متداول ترین این ترکیبات می باشد که با رقت مناسب(10درصد) می تواند بدین منظور از آن استفاده نمود. همچنین بعضی محصولات Deconex از جمله 50AF و Surface AF نیز برای این کار مناسب می باشند. توصیه می شود بعد از ضد عفونی با این ترکیبات، سطوح و تجهیزات را با الکل 70 % نیز ضدعفونی کرد که کار کامل گردد و همچنین از اثرات مخرب احتمالی ترکیبات کلر بر روی تجهیزات جلوگیری کرد. نکته دیگر که بسیار حائز اهمیت می باشد بحث نگهداری این ترکیبات می باشد. الکل و دیگر ترکیبات زمانی که رقیق می شوند میزان پایداری آن ها تا حد زیادی کاهش می یابد(الکل با آب مقطر 1 هفته، آب ژاول دو هفته)، بنابراین باید در نظر داشت که در مقادیر مناسب تهیه شود تا مدت زمان طولانی نگهداری نشود.